Development of tlc/densitometry for quantitative determination of flavonoid m from marigold (Tagetes erectus L.) leaf powder and its frap activity

Abstract

Abstract

            The objective of this study was to develop quantitative analytical method for active antioxidant ‘Flavonoid M’, (5, 3’, 4’-trihydroxyflavone 7-C-glucoside); in Marigold (Tagetes erectus L.) leaf by TLC/Densitometry. Parameters for analytical method according to APVMA (Australian Pesticides &Veterinary Medicine Authority) were determined for validity of the designed method. Application of developed method was used to determine the content of active flavonoid M in dried leaf powder and dried ethanol leaf extract. Ferric reduction power assay (FRAP) of ethanol extract and flavonoid M was also determined compared to standard 3-hydroxyflavone. Result showed that the developed analytical method had validation parameter conforming to APVMA criteria (2004). 1.0 g marigold leaf powder contains 7.59-12.04 mg flavonoid M and dried leaves extract contained 20.4 mg% w/w flavonoid M. For ferric reduction power assay (FRAP), flavonoid M had the slightly lower potency than standard 3-hydroxyflavone (EC₅₀: flavonoid M 42.46 mg/ml, 3-hyroxyflavone 30.37 mg/ml, ethanol leaf extract 74.96 mg/ml)

บทคัดย่อ

            รายงานการวิจัยเป็นการพัฒนาวิธีวิเคราะห์ปริมาณสาร Flavonoid M (5, 3’, 4’-trihydroxyflavone 7-C-glucoside)  ที่แยกได้จากสารสกัดใบดาวเรืองโดยใช้เครื่องมือวิเคราะห์คือTLC/Densitometer เกณฑ์ในการพิจารณาคุณภาพของวิธีวิเคราะห์ที่พัฒนาขึ้นยึดตาม APVMA criteria (2004)  ซึ่งเป็นเอกสารแนะนำการพัฒนาวิธีวิเคราะห์สำหรับสารเคมีที่มีฤทธิ์ที่ได้มาจากผลผลิตทางการเกษตรหรือจากพวกปศุสัตว์ โดยรัฐบาลของประเทศออสเตรเลีย โดยมีการกำหนดหัวข้อทดสอบสำหรับวิธีวิเคราะห์ที่พัฒนาขึ้น ได้แก่ ความได้กลับคืนจากการวิเคราะห์ (Accuracy) ความแม่นยำของวิธีวิเคราะห์ (Precision) ความจำเพาะเจาะจงแก่สารที่จะวิเคราะห์ (Specificity) ช่วงความสัมพันธ์ที่เป็นเส้นตรงระหว่างปริมาณสารกับสัญญาณที่ได้จากเครื่องมือ (linearity & range) ค่าต่ำสุดที่วิเคราะห์ได้แม่นยำ (Limit of quantitation) ค่าต่ำสุดที่เครื่องน่าจะตรวจพบได้ (Limit of detection) ซึ่งนอกจากหัวข้อดังกล่าว การวิเคราะห์ที่พัฒนาขึ้นยังแสดง ข้อมูลด้านความไว (Sensitivity) ของเครื่องมือด้วยการใช้สารปริมาณน้อยให้เครื่องตรวจวัด ทำให้พบข้อมูลที่น่าสนใจอีกประการหนึ่งว่า การใช้ความสูงของ peak ที่ได้จากเครื่อง นั้นมีความแปรผันน้อยกว่าการใช้สัญญาณของพื้นที่ของ peak ผลการวิเคราะห์ข้อมูลสำหรับสาร Flavonoid M กับเครื่อง TLC/Densitometer พบว่า วิธีวิเคราะห์ที่พัฒนาขึ้นได้มาตรฐานตามเกณฑ์ของ APVMA2004 ที่กำหนดไว้ เมื่อนำวิธีที่พัฒนาขึ้นไปวิเคราะห์หาปริมาณ Flavonoid M จากสารสกัดแอลกอฮอล์เหลวจากส่วนใบของดาวเรือง และสารสกัดเหลวที่ทำให้แห้งที่เตรียมจากใบดาวเรือง พบว่าปริมาณ Flavonoid M จากทั้งสองแหล่งให้ผลไม่แตกต่างกันในทางสถิติที่ระดับนัยสำคัญ 0.05 (T-test: P=0.001, F-test: 0.021) วิธีที่พัฒนาขึ้นนี้จึงสามารถใช้ในการควบคุมปริมาณ Flavonoid M จากทั้งสารสกัดเอทานอลเหลวภายหลังสกัดได้จากพืชโดยตรง หรือจะวิเคราะห์ในรูปสารสกัดแห้ง ก็สามารถทำได้ รายงานยังได้ยืนยันว่าสาร Flavonoid M มีฤทธิ์เป็น antioxidant เหมือนสารฟลาโวนอยด์โดยทั่วไป โดยใช้วิธี FRAP method ผลการทดสอบพบว่าสาร Flavonoid M มีฤทธิ์รีดักชันเฟอริกไอออนได้ใกล้เคียงกับสารสังเคราะห์ 3-hydroxyflavone โดยทดสอบร่วมกับสารสกัดหยาบร่วมด้วย แม้จะยืนยันฤทธิ์ antioxidant เพียงวิธีการเดียว แต่วิธีการทดสอบฤทธิ์ FRAP ดังกล่าวเป็นวิธีใหม่ที่ทดสอบด้วย 96 well plate ที่พัฒนาขึ้นจากวิธีเดิมของ Ferreira ICFR นอกจากนี้ผลวิเคราะห์ยังยืนยันได้ว่า สาร Flavonoid M นั้นเป็นสารหลักที่ออกฤทธิ์ในสารสกัดเมื่อทดสอบด้วยวิธี FRAP เพราะสารดังกล่าว (ตัวเดียว) มีฤทธิ์แรงกว่าสารสกัดจากใบ (มีสารผสมหลายตัว) ถึง 1.76 เท่า