การแยกเม็ดเลือดขาวชนิดโมโนซัยท์อย่างง่ายโดยวิธีการปั่นแยกด้วยเปอร์คอล

Abstract

บทคัดย่อ

ความเป็นมา: เม็ดเลือดขาวชนิดโมโนซัยท์ (monocytes) มีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกัน และเป็นเซลล์ต้นกำเนิด (precursor) ของ แม็คโครฟาร์จ (macrophages) ในเนื้อเยื่อของร่างกาย เซลล์เหล่านี้จะทำหน้าที่กำจัดเชื้อโรค และนำเสนอแอนติเจนต่อ T cells รวมทั้งหลั่งไซโตไคน์ (cytokines) ได้หลายชนิด ซึ่งควบคุมระบบภูมิคุ้มกัน วัตถุประสงค์: เพื่อศึกษาหาเปอร์เซ็นต์ของโมโนซัยท์ที่แยกได้ หาเปอร์เซ็นต์ของโมโนซัยท์ที่มีชีวิต และหาเปอร์เซ็นต์ของโมโนซัยท์ที่แยกได้ที่สามารถทำหน้าที่ phagocytosis ได้โดยวิธีการปั่นแยกด้วยเปอร์คอล ซึ่งเป็น hyperosmotic density gradient medium วิธีการศึกษา: เราใช้ส่วนเม็ดเลือดขาว (buffy coat) ของผู้บริจาคโลหิต ที่สถาบันพยาธิวิทยาซึ่งเป็นส่วนประกอบของโลหิตที่ทางสถาบันพยาธิวิทยาเหลือทิ้ง จำนวน 13 ราย มาศึกษา โดยมีขั้นตอนการดำเนินการ คือ ปั่นแยก PBMC จาก buffy coat โดยใช้ Ficoll-Hypaque gradient (density = 1.070 g/mL) จากนั้นจึงปั่นแยกโมโนซัยท์จาก PBMC โดยใช้ hyperosmolar Percoll gradient (density = 1.064 g/ml) หาเปอร์เซนต์ของโมโนซัยท์ที่แยกได้ โดยการย้อมด้วย monoclonal antibodies ต่อ CD45/CD14 และวัดโดยวิธี โฟลไซโตเมทรี และหาเปอร์เซนต์ของโมโนซัยท์ที่มีชีวิต (viability) โดยย้อมด้วยสี trypan blue และศึกษาว่าโมโนซัยท์ที่แยกได้สามารถทำหน้าที่ phagocytosis ได้หรือไม่ มากน้อยเพียงใด โดยการนับจำนวนเปอร์เซนต์ของเซลล์ซึ่งสามารถจับกิน latex beads ได้ ผลการศึกษา: พบว่า เปอร์เซนต์ของโมโนซัยท์ที่แยกได้ และเปอร์เซนต์ของโมโนซัยท์ที่มีชีวิต (viability) มีค่าสูง (95.3% และ 94.1% ตามลำดับ) ค่าเฉลี่ยของเปอร์เซนต์ของโมโนซัยท์ที่มีอยู่ใน PBMC ที่สามารถแยกได้เมื่อใช้ Ficoll-Hypaque gradient คือ 21% และจาก PBMC จำนวน 150 x 106 เซลล์ เมื่อใช้เปอร์คอล จะได้ค่าเฉลี่ยของโมโนซัยท์ คือ 16.8 x 106 เซลล์ ซึ่งมีเปอร์เซนต์โมโนซัยท์อยู่คิดเป็น 81.3% (% purity) และ คิดเป็นจำนวนเซลล์ 43.1% (% recovery) สำหรับโมโนซัยท์ที่แยกโดยวิธีนี้ได้สามารถทำหน้าที่ phagocytosis ได้ 74.8% สรุป: จะเห็นได้ว่าวิธีนี้เป็นวิธีที่ง่าย รวดเร็ว ไม่ใช้เครื่องมือที่มีราคาแพง และได้ผลดี คือเปอร์เซ็นต์โมโนซัยท์สูง เหมาะสำหรับห้องปฏิบัติการที่มีงบประมาณจำกัด และสามารถนำไปใช้ในงานวิจัยด้านภูมิคุ้มกันวิทยาอื่นๆ ต่อไปได้

คำสำคัญ: การแยกโมโนซัยท์ • เปอร์คอล • การแยกตามความหนาแน่น • ชั้นเม็ดเลือดขาว buffy coat

Abstract

Background: Monocytes play important roles in human immune system and are precursors of macrophages in body tissues. They have responsibility for phagocytosis of foreign substances and present antigens to T lymphocytes including production of many cytokines in order to control the immune system. Objectives: 1) To study and establish the method of human blood monocyte isolation by using Percoll density gradient for an alternative method. 2) To determine monocyte purity, viability, yields and phagocytosis function after isolation by Percoll density gradient. Methods: Acid citrate dextrose blood from 13 healthy blood donors was obtained from blood bank and the buffy coat of blood sample of each donor was used in each experiment. Two step procedure with single gradient in each step for monocytes isolation from whole blood was used. First, we used a Ficoll-Hypaque gradient (density = 1.070 g/mL) for seperation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and then a slight hyperosmolar Percoll gradient (density = 1.064 g/ml). PBMC was counted and viability was estimated by trypan blue dry exclusion. Percentage of monocytes after the Percoll gradient was determined by CD45/CD14 staining and analysis using Flow cytometer. The functional monocytes were detected by phagocytosis of latex beads. Results: Our study demonstrated high percentage of viability of both PBMC and monocyte determined by trypan blue exclusion (95.3 and 94.1, respectively). The average of percentage of monocytes present in the PBMC recovered from the initial Ficoll-Hypaque gradient was found to be 21.0 % monocytes. From PBMC 150 x 106 cells, using Percoll gradient, an average of 16.8 x 106 monocytes with a purity of 81.3% and a recovery of 43.1% were obtained. The functional monocytes detected by phagocytosis of latex beads was shown to be 74.8 %.

Conclusion: Percoll density gradient procedure provides highly purified human monocytes and can be done with usual reagents and equipment of average laboratory. Thus, this procedure is still attractive alternative method for resource limited settings because it is convenient, simple and cheap and can be applied for the other immunological research.

Key Words: Isolation of monocytes • Percoll • Density gradient • Human buffy coat