การตรวจหาสารพันธุกรรมตกค้างของเซลล์เพาะเลี้ยง Vero ในผลิตภัณฑ์วัคซีนไวรัสโดยวิธี Real-time Polymerase Chain Reaction
คำสำคัญ:
Vero cell, residual DNA, Real-time PCRบทคัดย่อ
เซลล์เพาะเลี้ยง Vero เป็นเซลล์เพาะเลี้ยงชนิดต่อเนื่องที่นำมาใช้ในการผลิตวัคซีนไวรัสหลายชนิดเนื่องจากมีความปลอดภัย ไม่ก่อให้เกิดมะเร็งและการติดเชื้อไวรัสแอบแฝง ทั้งนี้ขึ้นกับกระบวนการผลิต การทำให้บริสุทธิ์ และการตรวจสอบควบคุมคุณภาพที่ดี โดยปัจจุบันองค์การอนามัยโลกให้การยอมรับปริมาณ DNA ตกค้างของเซลล์เพาะเลี้ยงไม่เกิน 10 นาโนกรัมต่อโด๊สในผลิตภัณฑ์วัคซีน สถาบันชีววัตถุจึงได้พัฒนาวิธีการวิเคราะห์หา DNA ตกค้างในวัคซีนด้วยวิธี Real-time PCR โดยตรวจหาปริมาณ DNA ตกค้างของเซลล์เพาะเลี้ยง Vero ในตัวอย่างวัคซีนไวรัสสำเร็จรูปจำนวน 16 ตัวอย่าง และตรวจสอบความถูกต้องของวิธีในพารามิเตอร์ต่างๆ ผลการศึกษาพบว่าทุกตัวอย่างมีปริมาณ DNA ตกค้างอยู่ระหว่าง 0.49-4.48 นาโนกรัมต่อโด๊ส ซึ่งต่ำกว่าเกณฑ์กำหนด เมื่อตรวจสอบความถูกต้องของวิธีพบว่า การทดสอบความเป็นเส้นตรงและช่วงการวิเคราะห์มีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์มากกว่า 0.990 ในทุกชุดการทดสอบ โดยช่วงวิเคราะห์ที่เหมาะสมอยู่ระหว่าง 0.03-3,000 พิโคกรัมต่อปฏิกิริยา วิธีมีความแม่นที่ดี สามารถตรวจหา DNA ตกค้างของเซลล์เพาะเลี้ยง Vero ที่เติมลงไปในตัวทำละลายวัคซีนได้ โดยมีค่าการคืนกลับที่ร้อยละ 87 มีความเที่ยงของวิธีดีเมื่อทำการทดสอบในวันและเวลาเดียวกัน มีค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนไม่เกินร้อยละ 25 และในการทดสอบความคงทนของวิธี ซึ่งใช้ผู้วิเคราะห์ 2 คน พบว่าผลในการวิเคราะห์หาปริมาณสารพันธุกรรมตกค้างมีค่าใกล้เคียงกัน โดยมีค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนรวมไม่เกินร้อยละ 25 แสดงวา่ วิธีมีความคงทนดี สรุป ได้ว่าวิธี Real-time PCR ที่พัฒนาขึ้นนี้ เมื่อนำมาใช้ตรวจวิเคราะห์หา DNA ตกค้างในผลิตภัณฑ์วัคซีนเป็นวิธีที่มีความเป็นเส้นตรง ความแม่น ความเที่ยง และความคงทนของวิธีดี
References
Yasumura Y, Kawakita M. The research for the SV40 by means of tissue culture technique. Nippon Rinsho 1963; 21(6): 1201-19.
Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. World Health organ Tech Rep Ser 1998; 878: i-vi, 1-101.
Cao S, Dong G, Tang J, Li J, Liu J, Shi L, et al. Development of a Vero cell DNA reference standard for residual DNA measurement in Chaina. Hum Vaccin Immunother 2012; 9(2): 413-9.
Yang H. Establishing acceptable limits of residual DNA. PDA J Pharm Sci Technol 2013; 67(2): 155-63.
DiPaolo B, Pennetti A, Nugent L, Venkat K. Monitoring impurities in biopharmaceuticals produced by recombinant technology. Pharm Sci Technolo Today 1999; 2(2): 70-82.
Mehta S, Keer JT. Performance characteristics of host-cell DNA quantification methods. BioProcess Int 2007; 5(9): 44-58.
Kung VT, Panfili PR, Sheldon EL, King RS, Nagainis PA, Gomez B, et al. Picogram quantitation of total DNA using DNA-binding proteins in a silicon sensor-based system. Anal Biochem 1990; 187(2): 220-7.
Wang X, Morgan DM, Wang G, Mozier NM. Residual DNA analysis in biologics development: review of measurement and quantitation technologies and future directions. Biotechnol Bioeng 2012; 109 (2): 307-17.
Hu B, Sellers J, Kupec J, Ngo W, Fenton S, Yang TY, et al. Optimization and validation of DNA extraction and real-time PCR assay for the quantitative measurement of residual host cell DNA in biopharmaceutical products. J Pharm Biomed Anal 2014; 88: 92-5.
Lee DH, Bae JE, Lee JH, Shin JS, Kim IS. Quantitative detection of residual E. coli host cell DNA by real-time PCR. J Microbiol Biotechnol 2010; 20(10), 1463-70.
Yang H, Zhang L, Galinski M. A probabilistic model for risk assessment of residual host cell DNA in biological products. Vaccine 2010; 28(19): 3308-11.
Broeders S, Huber I, Grohmann L, et al. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR Methods. Trends in Food Science & Technology 2014; 37: 115-26.
