การพัฒนาชุดน้ำยา DMSc COVID-19 real-time RT-PCR
คำสำคัญ:
โรคโควิด-19, เชื้อ SARS-CoV-2, เรียลไทม์ อาร์ที พีซีอาร์บทคัดย่อ
การตรวจวินิจฉัยเชื้อก่อโรคโควิด-19 มีความสำคัญสำหรับการตรวจคัดกรองและยืนยันการติดเชื้อในผู้ป่วย ผู้สัมผัส และกลุ่มเสี่ยง เพื่อให้ผู้ติดเชื้อได้รับการรักษาอย่างเหมาะสมและทันท่วงที จึงได้พัฒนาชุดน้ำยา DMSc COVID-19 real-time RT-PCR สำหรับตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อโควิด-19 โดยตรวจยีนเป้าหมาย RdRp และ N ร่วมกับการประเมินวิธีการเตรียมสารพันธุกรรม RNA โดยวิธีให้ความร้อน และโดยน้ำยาย่อยสลายเซลล์ และประเมินน้ำยาเพิ่มประสิทธิภาพในปฏิกิริยา real-time RT-PCR จำนวน 5 ชนิด ได้แก่ Tween20 (0.5%) Glycerol (10, 15, 20%) Dimethyl sulfoxide (10%) Bovine serum albumin (10 mg/mL) และ Triton X-100 (0.1%) พบว่าความไวในการตรวจหายีน RdRp และยีน N ที่ความเข้มข้นต่ำสุด คือ 50 และ 5 copies ต่อ reaction ตามลำดับ การเตรียมตัวอย่างสารพันธุกรรมด้วยวิธี heat และ direct lysis มีความไวร้อยละ 97.14 และ 100 และความจำเพาะร้อยละ 95.89 และ 94.52 ตามลำดับ และพบว่าน้ำยาเพิ่มประสิทธิภาพซึ่งประกอบด้วย Tween 20 (0.5%) และ Glycerol (15%) มีความไวและความจำเพาะในการตรวจยีนเป้าหมายร้อยละ 100 แสดงว่าชุดน้ำยา DMSc COVID-19 real-time RT-PCR ที่พัฒนาขึ้นนี้ สามารถใช้ร่วมกับการเตรียมตัวอย่างโดยตรงโดยไม่ผ่านกระบวนการสกัดสารพันธุกรรมได้ ทำให้ช่วยลดต้นทุนการตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการและมีความรวดเร็วยิ่งขึ้น สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการควบคุมและตรวจวินิจฉัยโรคโควิด-19 ได้
References
World Health Organization. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) situation report – 146: data as received by WHO from national authorities by 10:00 CEST, 14 June 2020. [online]. 2020; [cited 2020 Jun 14]; [17 screens]. Available from: URL: https://www.who.int/docs/defaultsource/coronaviruse/situation-reports/20200614-covid-19-sitrep-146.pdf?sfvrsn=5b89bdad_6.
Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 2020; 25(3): 2000045. (8 pages).
Tu YF, Chien CS, Yarmishyn AA, Lin YY, Luo YH, Lin YT, et al. A review of SARS-CoV-2 and the ongoing clinical trials. Int J Mol Sci 2020; 21(7): 2657. (19 pages).
Chittaganphich M. COVID-19. Bull Dept Med Sci 2020; 62(1): 1-5.
Chen Y, Chen L, Deng Q, Zhang G, Wu K, Ni L, et al. The presence of SARS-CoV-2 RNA in the feces of COVID-19 patients. J Med Virol 2020; 92(7): 833-40.
Centers for Disease Control and Prevention. CDC 2019-novel coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. [online]. 2020; [cited 2020 May 15]; [59 screens]. Available from: URL: https://www.fda.gov/media/134922/download.
Okada P, Buathong R, Phuygun S, Thanadachakul T, Parnmen S, Wongboot W, el al. Early transmission patterns of coronavirus disease 2019 (COVID-19) in travellers from Wuhan to Thailand, January 2020. Euro Surveill 2020; 25(8). 2000097. (5 pages).
Johnson G, Nolan T, Bustin SA. Real-time quantitative PCR, pathogen detection and MIQE. Methods Mol Biol 2013; 943: 1-16.
World Health Organization. real-time RT-PCR protocol for the detection of avian influenza A(H7N9) virus. [online]. 2013; [cited 2020 May 15]; [6 screens]. Available from: URL: https://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/cnic_realtime_rt_pcr_protocol_a_h7n9.pdf.
Harada S. DNA and RNA extractions from mammalian samples. In: Micic M. Sample preparation techniques for soil, plant, and animal samples. New York Springer Science Business Media; 2016. p. 125-138.
Van Stralen KJ, Stel VS, Reitsma JB, Dekker FW, Zoccali C, Jager KJ. Diagnostic methods I: sensitivity, specificity, and other measures of accuracy. Kidney Int 2009; 75(12): 1257-63.
Vogels CBF, Brito AF, Wyllie AL, Fauver JR, Ott IM, Kalinich CC, et al. Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-COV-2 qRT-PCR primer-probe sets. medRxiv. [serial online]. 2020; [cited 2020 May 15]; XX(XX): [20 screens]. Available from: URL: https://www.medrxiv.org/content/medrxiv/early/2020/04/26/2020.03.30.20048108.full.pdf.
Shatzkes K, Teferedegne B, Murata H. A simple, inexpensive method for preparing cell lysates suitable for downstream reverse transcription quantitative PCR. Sci Rep 2014; 4: 4659. (7 pages).
Grant PR, Turner MA, Shin GY, Nastouli E, Levett LJ. Extraction-free COVID-19 (SARS-CoV-2) diagnosis by RT-PCR to increase capacity for national testing programmes during a pandemic. bioRxiv. [serial online]. 2020; [cited 2020 May 15]; XX(XX): [6 screens]. Available from: URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.06.028316v1.full.pdf.
Montgomery JL, Wittwer CT. Influence of PCR reagents on DNA polymerase extension rates measured on real-time PCR Instruments. Clin Chem 2014; 60(2): 334–40.
