การพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซีนไคเนสเพื่อค้นหาสารต้านมะเร็ง
คำสำคัญ:
มะเร็ง, ระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งเอนไซม์ไทโรซีนไคเนส, สารยับยั้งการทำงานของไทโรซีนไคเนส, เป้าหมายยาต้านมะเร็งบทคัดย่อ
ไทโรซีนไคเนสมีบทบาทสำคัญในการส่งสัญญาณต่างๆ ภายในเซลล์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเจริญ การแพร่กระจาย การลุกลาม และการสร้างหลอดเลือดใหม่ของเซลล์มะเร็ง โปรตีนกลุ่มนี้หลายชนิดใช้ในการรักษามะเร็งแบบมุ่งเป้า การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งการทำงานของไทโรซีนไคเนสจากตัวอย่างสารจำนวนมาก คณะผู้วิจัยได้พัฒนาระบบทดสอบ โดยเริ่มจากการศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนกลุ่มนี้ในเซลล์มะเร็งเพาะเลี้ยง 4 ชนิด ด้วยวิธี quantitative real-time PCR รวมทั้งวัดระดับการทำงานของไทโรซีนไคเนสใน cell lysate แต่ละชนิดด้วยวิธี ELISA เพื่อคัดเลือกเซลล์ที่เหมาะสม คัดเลือกเซลล์ HeLa สำหรับพัฒนาระบบทดสอบ จากนั้นศึกษาสภาวะที่เหมาะสม พบว่าปริมาณ cell lysate 0.125 mg/mL peptide substrate 0.25 μg ต่อหลุม ATP 25 nM และเวลาในการทำปฏิกิริยา 30 นาที เหมาะสมสำหรับการทำปฏิกิริยาไคเนส เมื่อทดสอบระบบที่พัฒนาด้วยสารที่มีฤทธิ์ยับยั้งมะเร็ง พบว่าสารกลุ่มที่มีฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของไทโรซีนไคเนสลดค่าสัญญาณในระบบได้ ทดสอบความใช้ได้ของระบบโดยวิเคราะห์ความแปรปรวนของค่าสัญญาณ พบว่าพารามิเตอร์ทุกค่าผ่านเกณฑ์การยอมรับ แสดงให้เห็นว่าระบบทดสอบนี้สามารถทำซ้ำได้และเหมาะสมสำหรับใช้ทดสอบสาร คณะผู้วิจัยยังนำระบบทดสอบดังกล่าวทดสอบฤทธิ์กับสารสกัดสมุนไพร 180 ตัวอย่าง และตรวจสอบยืนยันฤทธิ์อีกครั้งด้วยวิธี MTT assay และ transmembrane assay พบสารที่แสดงฤทธิ์ต้านมะเร็งในเซลล์เพาะเลี้ยงจริงระบบทดสอบที่พัฒนาขึ้นจึงเหมาะสมเป็นระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซีนไคเนส
References
Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2021; 71(3): 209-49.
กลุ่มข้อมูลข่าวสารสุขภาพ. สถิติสาธารณสุข พ.ศ. 2562. นนทบุรี: กองยุทธศาสตร์และแผนงาน สำนักงานปลัดกระทรวงสาธารณสุข; 2563. หน้า 78-79.
Padma VV. An overview of targeted cancer therapy. BioMedicine. [serial online]. 2015; [cited 2021 Oct 21]; 5(4): [6 screens]. Available from: URL: https://biomedicine.cmu.edu.tw/doc/17-1.pdf.
Gocek E, Moulas AN, Studzinski GP. Non-receptor protein tyrosine kinases signaling pathways in normal and cancer cells. Crit Rev Clin Lab Sci 2014; 51(3): 125-37.
Du Z, Lovly CM. Mechanisms of receptor tyrosine kinase activation in cancer. Mol Cancer. [serial online]. 2018; [cited 2021 Oct 21]; 17: [13 screens]. Available from: URL: https://doi.org/10.1186/s12943-018-0782-4.
Pottier C, Fresnais M, Gilon M, Jérusalem G, Longuespée R, Sounni NE. Tyrosine kinase inhibitors in cancer: breakthrough andchallenges of targeted therapy. Cancers. [serial online]. 2020; [cited 2021 Oct 21]; 12(3): [17 screens]. Available from: URL: https://doi.org/10.3390/cancers12030731.
Metibemu DS, Akinloye OA, Akamo AJ, Ojo DA, Okeowo OT, Omotuyi IO. Exploring receptor tyrosine kinases-inhibitors in cancer treatments. Egypt J Med Hum Genet. [serial online]. 2019; [cited 2021 Oct 21]; 20(1): [16 screens]. Available from: URL: https://doi.org/10.1186/s43042-019-0035-0.
Gopalakrishna R, Chen ZH, Gundimeda U, Wilson JC, Anderson WB. Rapid filtration assays for protein kinase C activity and phorbol ester binding using multiwell plates with fitted filtration discs. Anal Biochem 1992; 206(1): 24-35.
Nakayama GR, Nova MP, Parandoosh Z. A scintillating microplate assay for the assessment of protein kinase activity. J Biomol Screen 1998; 3(1): 43-8.
Park YW, Cummings RT, Wu L, Zheng S, Cameron PM, Woods A, et al. Homogeneous proximity tyrosine kinase assays: scintillation proximity assay versus homogeneous time-resolved fluorescence. Anal Biochem 1999; 269(1): 94-104.
Kumar EA, Charvet CD, Lokesh GL, Natarajan A. High-throughput fl uorescence polarization assay to identify inhibitors of Cbl(TKB)-protein tyrosine kinase interactions. Anal Biochem 2011; 411(2): 254-60.
Rodems SM, Hamman BD, Lin C, Zhao J, Shah S, Heidary D, et al. A FRET-based assay platform for ultra-high density drug screening of protein kinases and phosphatases. Assay Drug Dev Technol 2002; 1(1): 9-19.
Koresawa M, Okabe T. High-throughput screening with quantitation of ATP consumption: a universal non-radioisotope, homogeneous assay for protein kinase. Assay Drug Dev Technol 2004; 2(2): 153-60.
King IC, Feng M, Catino JJ. High throughput assay for inhibitors of the epidermal growth factor receptor-associated tyrosine kinase. Life Sci 1993; 53(19): 1465-72.
Baumann CA, Zeng L, Donatelli RR, Maroney AC. Development of a quantitative, high-throughput cell-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of colonystimulating factor-1 receptor tyrosine kinase inhibitors. J Biochem Bioph Methods 2004; 60(1): 69-79.
Zhang XH, Guo XN, Zhong L, Luo XM, Jiang HL, Lin LP, et al. Establishment of the active catalytic domain of human PDGFRß tyrosine kinase-based ELISA assay for inhibitor screening. Biochim Biophys Acta 2007; 1770(10): 1490-7.
Angeles TS, Steffl er C, Bartlett BA, Hudkins RL, Stephens RM, Kaplan DR, et al. Enzymelinked immunosorbent assay for trkA tyrosine kinase activity. Anal Biochem 1996; 236(1): 49-55.
Bauer SM, Gehringer M, Laufer SA. A direct enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the quantitative evaluation of Janus kinase 3 (JAK3) inhibitors. Anal Methods 2014; 6(21): 8817-22.
Spandidos A, Wang X, Wang H, Seed B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantifi cation. Nucleic Acids Res. [serial online]. 2009; [cited 2021 Oct 21]; 38: [8 screens]. Available from URL: https://doi.org/10.1093/nar/gkp1005.
Barber RD, Harmer DW, Coleman RA, Clark BJ. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiol Genomics 2005; 21(3): 389-95.
Ghosh G, Yan X, Kron SJ, Palecek SP. Activity assay of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in triple-negative breast cancer cells using peptide-conjugated magnetic beads. Assay Drug Dev Technol 2013; 11(1): 44-51.
Iversen PW, Beck B, Chen YF, Dere W, Devanarayan V, Eastwood BJ, et al. HTS assay validation. In: Assay guidance manual.[online]. 2012; [cited 2021 Oct 21]: [26 screens]. Available from: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783.
Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen 1999; 4(2): 67-73.
Riss TL, Moravec RA, Niles AL, Duellman S, Benink HA, Worzella TJ, et al. Cell viability assays. In: Assay guidance manual. [online]. 2012; [cited 2021 Oct 21]: [25 screens]. Available from: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065.
Hulkower KI, Herber RL. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics 2011; 3(1): 107-24.
Settasupana K, Pruksakorn P, Leunchaichaweng A, Prachasuphap A, Dhepakson P. Cloning, expression and purifi cation of human CXCL12 alpha recombinant protein. Poster session presented at: The 24th Annual Medical Sciences Conference; Thailand. [online]. 2016 Jun 1-3; [cited 2021 Oct 21]: [1 screen]. Available from: URL: http://e-library.dmsc.moph.go.th/ebooks/files/P2-11%20กัญจน์รัชต์.pdf.
Dillenburg-Pilla P, Patel V, Mikelis CM, Zárate-Bladés CR, Doçi CL, Amornphimoltham P, et al. SDF-1/CXCL12 induces directional cell migration and spontaneous metastasis via a CXCR4/Gαi/mTORC1 axis. FASEB J 2015; 29(3): 1056-68.
Hughes JP, Rees S, Kalindjian SB, Philpott KL. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol 2011; 162(6): 1239-49.
Nicholson RI, Gee JMW, Harper ME. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer 2001; 37(Suppl 4): S9-15.
Miyamoto M, Ojima H, Iwasaki M, Shimizu H, Kokubu A, Hiraoka N, et al. Prognostic signifi cance of overexpression of c-Met oncoprotein in cholangiocarcinoma. Br J Cancer 2011; 105(1): 131-8.
Chung CY, Yeh KT, Hsu NC, Chang JHM, Lin JT, Horng HC, et al. Expression of c-kit protooncogene in human hepatocellular carcinoma. Cancer Lett 2005; 217(2): 231-6.
Nagaraj N, Wisniewski JR, Geiger T, Cox J, Kircher M, Kelso J, et al. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol. [serial online]. 2011; [cited 2021 Oct 21]; 7(1): [8 screens]. Available from: URL: https://doi.org/10.1038/msb.2011.81.
Herskovits TT, Gadegbeku B, Jaillet H. On the structural stability and solvent denaturation of proteins. I. Denaturation by the alcohols and glycols. J Biol Chem 1970; 245(10): 2588-98.
Tjernberg A, Markova N, Griffi ths WJ, Hallén D. DMSO-related eff ects in protein characterization. J Biomol Screen 2006; 11(2): 131-7.
Lestari D, Kartika R, Marliana E. Antioxidant and anticancer activity of Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb on leukemia cells L1210. J Phys Conf Ser. [serial online]. 2019; [cited 2021 Oct 21]: 1277: [7 screens]. Available from: URL: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1742-6596/1277/1/012022.
Suwarso E. The apoptosis eff ects of ethylacetate extract of Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. against T47D cells. Int J PharmTech Res 2014-2015; 7(3): 535-9.
Widowati W, Wijaya L, Wargasetia T, Bachtiar I, Yelliantty Y, Laksmitawati D. Antioxidant, anticancer, and apoptosis-inducing eff ects of Piper extracts in Hela cells. J Exp Integr Med 2013; 3(3): 225-30.
Boontha S, Taowkaen J, Phakwan T, Worauaicha T, Kamonnate P, Buranrat B, et al. Evaluation of antioxidant and anticancer eff ects of Piper betle L (Piperaceae) leaf extract on MCF-7 cells, and preparation of transdermal patches of the extract. Trop J Pharma Res 2019; 18(6): 1265-72.
Duong TH, Bui XH, Pogam PL, Nguyen HH, Tran TT, Nguyen TAT, et al. Two novel diterpenes from the roots of Phyllanthus acidus (L.) Skeel. Tetrahedron 2017; 73(38): 5634-8.
Geng HC, Zhu HT, Yang WN, Wang D, Yang CR, Zhang YJ. New cytotoxic dichapetalins in the leaves of Phyllanthus acidus: Identifi cation, quantitative analysis, and preliminary toxicity assessment. Bioorg Chem. [serial online]. 2021; [cited 2021 Oct 21]; 114: [6 screens]. Available from: URL: https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105125.
Kwan YP, Saito T, Ibrahim D, Al-Hassan FM, Ein Oon C, Chen Y, et al. Evaluation of the cytotoxicity, cell-cycle arrest, and apoptotic induction by Euphorbia hirta in MCF-7 breast cancer cells. Pharm Biol 2016; 54(7): 1223-36.
Silva GL, Kinghorn AD, Lee IS. Special problems with the extraction of plants. In: Cannell RJP, editors. Natural products isolation. New Jersey: Humana Press; 1998. p. 343-363.
Tanaka T, Nonaka GI, Nishioka I. Tannins and related compounds. XL. Revision of the structures of Punicalin and Punicalagin, and isolation and characterization of 2-O-galloylpunicalin from the bark of Punica granatum L. Chem Pharm Bull 1986; 34(2): 650-5.
Ahmad W, Singh S, Kumar S. Phytochemical screening and antimicrobial study of Euphorbia hirta extracts. J Med Plants Stud 2017; 5(2): 183-6.
Downloads
เผยแพร่แล้ว
How to Cite
ฉบับ
บท
License
Copyright (c) 2022 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
